51
αιτιολογίας νέων και σημαντικών ασθενειών σε φυτώρια και οπωρώνες, η ανάπτυξη καινοτόμων
μεθόδων ταυτόχρονου ελέγχου της φυτοϋγείας του παραγόμενου υλικού και η προώθηση της
αντιμετώπισης των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών με βιοτεχνολογικές μεθόδους. Το 2013
πραγματοποιήθηκαν οι παρακάτω εργασίες:
Α. Ανάπτυξη της καινοτόμου Multiplex Real time RT-PCR για ιούς, ιοειδή και φυτοπλάσματα
μηλοειδών. Η συλλογή φυτικών ιστών μολυσμένων με τους σημαντικότερους ιούς, ιοειδή και
φυτοπλάσματα που δημιουργήθηκε το προηγούμενο έτος, εμπλουτίστηκε με νέες απομονώσεις
από την Πελοπόννησο και από το Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο CRA-PAV στη Ρώμη. Για την
εξαγωγή του ιικού RNA από τους φυτικούς ιστούς αξιολογήθηκε και υιοθετήθηκε η μέθοδος των
Gambino et al., (2008) ενώ για την εξαγωγή ολικών νουκλεϊκών οξέων από ιστούς μολυσμένους
με ιοειδή και φυτοπλάσματα αξιολογήθηκε ως αποτελεσματικότερη η μέθοδος των Ahrens και
Seemuller (1992). Επιλέχθηκαν δημοσιευμένοι εκκινητές για την ανίχνευση όλων των παθογόνων
ενδιαφέροντος με την κλασσική μοριακή μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτής
αντίδρασης της πολυμεράσης (RT-PCR). Τα προϊόντα της PCR κλωνοποιήθηκαν και με τη
μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής δημιουργήθηκαν τα αντίστοιχα πρότυπα (μεταγραμμένο
RNA ή πλασμιδιακό DNA) για χρήση και αξιολόγηση δοκιμών real time PCR έναντι ενός ή
περισσοτέρων στόχων (Multiplex Real time PCR) ανά αντίδραση.
Για την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου της ταυτόχρονης ανίχνευσης ιοειδών (
Pear blister canker
viroid
-PBCVd και
Apple scar skin viroid
ASSVd) και φυτοπλασμάτων (“
Ca
. Phytoplasma mali”, και
“
Ca.
Phytoplasma pyri”) αξιολογήθηκαν oι εκκινητές και ιχνηλάτες που είχαν σχεδιαστεί για τα
ιοειδή. ενώ για την ανίχνευση των φυτοπλασμάτων χρησιμοποιήθηκε ήδη δημοσιευμένο ζεύγος
εκκινητών και ιχνηλάτης. Η ταυτόχρονη ανίχνευση των παθογόνων κατέστη πράγματι δυνατή και
σε αυτό το στάδιο ελέγχονται οι παράμετροι για τη βελτιστοποίηση της ευαισθησίας της μεθόδου
με στόχο την ελαχιστοποίηση διαφορών μεταξύ αντιδράσεων με έναν ή πολλαπλούς στόχους.
Για την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου της ταυτόχρονης ανίχνευσης ιών (
Apple chlorotic leaf
spot virus-
ACLSV,
Apple mosaic virus
-ApMV,
Apple stem grooving virus
-ASGV και
Apple stem
pitting
virus-ASPV) με Multiplex Real time PCR δοκιμάστηκε RT-qPCR σε ένα στάδιο και κοινό
μικροσωλήνα (one step) και σε δύο στάδια και διαφορετικούς μικροσωλήνες (two step).
Επετεύχθη η ταυτόχρονη ανίχνευση τριών στόχων αφού προηγήθηκε ενδελεχής έλεγχος και
βελτιστοποίηση των διαφόρων παραμέτρων. Σχεδιάστηκε επίσης νέος ιχνηλάτης για τον ACLSV
σημασμένος με διαφορετική φθορίζουσα χρωστική από τις έως τώρα χρησιμοποιούμενες ώστε να
δοκιμαστεί ταυτόχρονη ανίχνευση τεσσάρων στόχων.
Β. Εξυγίανση αχλαδιάς ποικ. Κοντούλα από το ιοειδές PBCVd. Πραγματοποιήθηκε επίσκεψη στο
Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο CRA-PAV της Ιταλίας με στόχο την εκπαίδευση στην τεχνική της
κρυοθεραπείας για την εξυγίανση φυτικού υλικού αχλαδιάς από ιούς και ιοειδή. Επίσης
επιχειρείται εγκατάσταση ιστοκαλλιέργειας ποικιλίας Κοντούλα μολυσμένης με το ιοειδές PBCVd
ώστε να δημιουργηθεί το κατάλληλο φυτικό υλικό για την εφαρμογή της κρυοθεραπείας.
Γ. Πραγματοποιήθηκαν επισκοπήσεις σε οπωρώνες πυρηνοκάρπων και γιγαρτοκάρπων για
διαπίστωση τυχόν παρουσίας προσβολών από φυτοπλάσματα. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε
μακροσκοπικός έλεγχος δένδρων σε πέντε περιοχές της Χώρας στους Νομούς Αττικής,
Φθιώτιδας, Αργολίδας και Ημαθίας και έγινε δειγματοληψία φυτικών ιστών για εργαστηριακό
έλεγχο. Μέχρι σήμερα, το 50% των ως άνω δειγμάτων φυτικών ιστών έχουν υποστεί επεξεργασία
για εξαγωγή νουκλεοτιδικών οξέων και έχει ελεγχθεί ως προς την ποιότητά του. Η επεξεργασία
των υπολοίπων δειγμάτων συνεχίζεται και καταβάλλεται προσπάθεια να τροποποιηθεί ώστε να
επιτρέπει τον ταυτόχρονο χειρισμό μεγαλύτερου αριθμού δειγμάτων. Θα ακολουθήσει ανίχνευση
τυχόν παρουσίας φυτοπλασμάτων στα εκχυλίσματα νουκλεοτιδικών οξέων με την εφαρμογή της
μεθόδου PCR με εξωτερικό και εσωτερικό ζεύγος εκκινητών (nested PCR).
Δ. Για τη μελέτη του παθοσυστήματος αχλαδιά –
Erwinia amylovora
, αναζητήθηκαν ποικιλίες
αχλαδιάς διαθέσιμες στην Χώρα μας για τις οποίες υπήρχαν βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με
