10
την ανίχνευση της παρουσίας των επιβλαβών μυκήτων καραντίνας
Synchytrium endobioticum
(412δείγματα)
, Glomerella gossypii
(125 δείγματα)
και
Phytophthora ramorum
(25 δείγματα), σύμφωνα
με την ισχύουσα Εθνική και Κοινοτική νομοθεσία. Οι μακροσκοπικοί έλεγχοι και οι δειγματοληψίες
έγιναν από τους τοπικούς φυτοϋγειονομικούς ελεγκτές σύμφωνα με τις επικαιροποιημένες
κατευθυντήριες οδηγίες μακροσκοπικών ελέγχων και δειγματοληψιών που συνέταξε το Εργαστήριο
Μυκητολογίας και οι οποίες αναρτήθηκαν στην ιστοσελίδα του ΜΦΙ (
). Για τις εργαστηριακές
εξετάσεις των δειγμάτων εφαρμόστηκαν διεθνώς αναγνωρισμένες μεθοδολογίες, όπως αυτές
προτείνονται από το Διεθνή Οργανισμό Προστασίας των Φυτών του FAO (International Plant Protection
Convention, IPPC-FAO) ή/και τον Ευρωπαϊκό και Μεσογειακό Οργανισμό Προστασίας των Φυτών
(European and Mediteranean Plant Protection Organisation, EPPO) και περιγράφονται στα αντίστοιχα
επίσημα διαγνωστικά πρωτόκολλα.
Επιπλέον, στο πλαίσιο του Προγράμματος των Επισκοπήσεων εφαρμόστηκαν και
αξιολογήθηκαν από το Εργαστήριο Μυκητολογίας μοριακές μέθοδοι ανίχνευσης και ταυτοποίησης των
φυτοπαθογόνων μυκήτων καραντίνας
S. endobioticum
και
P. ramorum,
που περιλαμβάνονται στα
Διαγνωστικά Πρωτόκολλα του EPPO ή στη Διεθνή Βιβλιογραφία με σκοπό τη μελλοντική εφαρμογή
τους σε περιπτώσεις θετικών δειγμάτων ή για επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της εργαστηριακής
εξέτασης των δειγμάτων με μεθόδους κλασικής Μυκητολογίας. Πιο συγκεκριμένα,
1. Για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του φυτοπαθογόνου μύκητα καραντίνας
S. endobioticum
εφαρμόστηκε η μέθοδος των Levesque
et al
. (2001) η οποία περιλαμβάνεται στο υπό
αναθεώρηση Διαγνωστικό Πρωτόκολλο του EPPO Standard PM 7/028(3). Η μέθοδος
εφαρμόστηκε με επιτυχία σε εκχυλίσματα DNA που απομονώθηκαν από (i) νεοσχηματισμένη
υπερπλασία με σποριάγγεια του μύκητα, (ii) υπερπλασία με σποριάγγεια του μύκητα σε
προχωρημένο στάδιο (δηλ. λίγο πριν την αποσύνθεση της υπερπλασίας), και (iii) χειμερινά
σποριάγγεια τα οποία παρελήφθησαν με τη μέθοδο της υγρής κοσκίνισης (wet sieving) (van
Leeuwen
et
al
., 2005) από μόλυσμα κομποστοποιημένο για 6 μήνες σε ποταμίσια άμμο και
από φυσικά επιμολυσμένο έδαφος αγρού. Aξιολόγηση της ευαισθησίας της μεθόδου από τους
van den Boogert
et al
. (2005) προσδιόρισε το ένα σποριάγγειο ως ελάχιστο αριθμό
σποριαγγείων από τα οποία είναι δυνατόν να απομονωθεί DNA και να ανιχνευθεί ως θετικό
στην αντίδραση PCR, με ποσοστά επαναληψιμότητας 40%. Κατά την εφαρμογή της μεθόδου
(εκχύλιση DNA & PCR) από το Εργαστήριο Μυκητολογίας, ήταν δυνατή η ανίχνευση του
μύκητα
S. endobioticum
σε αντίδραση PCR με χρήση εκχυλίσματος DNA το οποίο
απομονώθηκε από ένα μεμονωμένο σποριάγγειο τουλάχιστον, με προτεινόμενο ασφαλές όριο
ανίχνευσης της μεθόδου (LOD) τα πέντε σποριάγγεια (Εικόνα 1α). Στο πλαίσιο βελτίωσης της
μεθοδολογίας δοκιμάσθηκε η χρήση διαφόρων μεταχειρίσεων (βρασμός, επώαση σε
θερμοκρασία 115°C, διαδοχική εφαρμογή κύκλων άμεσης κατάψυξης/απόψυξης με χρήση
υγρού αζώτου) για τη θραύση των σποριαγγείων με σκοπό την απομόνωση DNA. Επίσης
δοκιμάσθηκε η χρήση του αντιδραστηρίου FastGene Direct PCR Kit με DNAreleasy (NIPPON
Genetics
®
) σε συνδυασμό με την KAPA2G robust Hot Start Ready mix PCR (KAPA
BIOSYSTEMS
®
), με σκοπό την παράκαμψη του σταδίου της απομόνωσης και καθαρισμού
DNA του
S. endobioticum
και απ’ ευθείας χρήση του μίγματος μετά τη λύση των κυττάρων σε
αντίδραση PCR. Η μέθοδος λειτούργησε με επιτυχία με μόνη περιοριστική παράμετρο τη
σχετικά μικρότερη ευαισθησία της μεθόδου (10 έως 50 σποριάγγεια) (Εικόνα 1β).
2. Για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του φυτοπαθογόνου μύκητα καραντίνας
Phytophthora
ramorum
αξιολογήθηκαν οι μέθοδοι PCR των Lane
et
al.
(2003) και Ioos
et
al
. (2006)
,
οι
οποίες περιλαμβάνονται στο Διαγνωστικό Πρωτόκολλο του EPPO Standard PM 7/66(1) και
στη Διεθνή Βιβλιογραφία, αντίστοιχα. Και οι δύο μέθοδοι δοκιμάσθηκαν με επιτυχία σε
εκχυλίσματα DNA από
in vitro
καλλιέργειες του μύκητα, με τη μέθοδο των Ioos
et
al
. (2006) να
εμφανίζει μεγαλύτερη ειδικότητα στην ανίχνευση του μύκητα σε σχέση με τη μέθοδο των Lane
et al
. (2003).
