75
εξεταζόμενο γονίδιο και η έκφραση τους συγκρίθηκε σε ένα πληθυσμό που παρουσιάζει ευαισθησία (S-
) στο glyphosate σε αντιδιαστολή με αυτά ενός ανθεκτικού πληθυσμού (R-). Σχετικά με τον μηχανισμό
ανάπτυξης, μετρήθηκε (μέσω real-time PCR) η σχετική έκφραση γονιδίων που αναφέρεται ότι
εμπλέκονται στο μηχανισμό ανθεκτικότητας της κόνυζας στο glyphosate. Μελετήθηκε η σχετική
έκφραση γονιδίων που αφορούν τους ABC-μεταφορείς καθώς και το γονίδιο για το ένζυμο EPSPS.
Πληθυσμοί και δειγματοληψία:
Έγιναν δύο δειγματοληψίες, 24 ώρες μετά την εφαρμογή του
ζιζανιοκτόνου καθώς και 4 μέρες μετά την εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου στις ποικιλίες Χ στο στάδιο Χ.
Αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (RΤ-PCR):
Για τα πειράματα
RT-PCR, ένα μικρογραμμάριο συνολικού RNA απομονώθηκε από φύλλα ανθεκτικών και ευαίσθητων
ποικιλιών κόνυζας, χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο απομόνωσης RNΑ με Trizol (Sigma). Εγινε
σύνθεση cDNA, χρησιμοποιώντας το Prime Script RT Reagent-Perfect Real Time Kit (Takara), το
οποίο χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο στις αντιδράσεις RT-PCR και Real Time PCR. Οι αλληλουχίες
των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν είναι δημοσιευμένες από τους Peng et al. 2010. To γονίδιο της
ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως RT-PCR control. To πρόγραμμα PCR που χρησιμοποιήθηκε είναι το
εξής: 3 min στους 94 °C, ακολουθούν 35 κύκλοι των: 30 s στους 94 °C; 30 s στους 60 °και 30 s στους
72 °C, κι ένα τελικό σταδιο στους 72 °για 10 min.
Real-Time PCR:
H ποσοτική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων ABC-transporters καθώς και του
γονιδίου EPSPS επιτεύχθηκε με πειράματα Real-Time PCR χρησιμοποιώντας το μηχάνημα Real
plex3 της Eppendorf. Tο πρόγραμμα της Real-Time PCR αναφέρεται στο Kappa Sybr Fast Universal
qPCR Kit. Η σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων πραγματοποιήθηκε
χρησιμοποιώντας το υπολογιστικό πακέτο REST για τον υπολογισμό της κανονικοποιημένης
αναλογίας της έκφρασης των γονιδίων. Το γονίδιο της ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς
για την κανονικοποίηση της ποσοτικοποίησης της έκφρασης των συγκεκριμένων γονιδίων.
H σχετική
αναλογία έκφρασης των γονιδίων για κάθε δείγμα συγκρίθηκε με την έκφραση των αντίστοιχων
γονιδίων στο δείγμα του μάρτυρα της ευαίσθητης ποικιλίας.
Εικόνα 1.
Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων Μ10, Μ11, Μ7, P3, EPSPS.
Τα ανωτέρω έγιναν στο πλαίσιο του έργου:
REGPOT BPI-PlantHeal 230010
Τ
ΜΗΜΑ
Ελέγχου Γεωργικών Φαρμάκων και
Φυτοφαρμακευτικής
Ε
ΡΓΑΣΤΗΡΙΟ
Ζιζανιολογίας
Ε
ΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΙ
Υ
ΠΕΥΘΥΝΟΙ
Δρ Α. Μαρκέλλου, Δρ Δ. Χάχαλης
Υ
ΠΕΥΘΥΝΟΣ
Ε
ΡΓΟΥ
Δρ Ε. Τάνη
Δ
ΙΑΡΚΕΙΑ ΕΡΓΟΥ
1.5.2009-31.12.2013
