51
2.2 Μελέτη των φυτοπαθογόνων οργανισμών, των μη παρασιτικών παθή-
σεων, των διαδικασιών παθογένεσης καθώς και των μηχανισμών άμυνας
των φυτών
2.2.1 Βελτιστοποίηση της παραγωγής υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού οπωρο-
φόρων δένδρων με σύγχρονες βιολογικές και βιοτεχνολογικές μεθόδους
(ΒΙΟΚΑΡΠΟΣ)
Στο πρόγραμμα ΒΙΟΚΑΡΠΟΣ που αποσκοπεί στη μελέτη και επίλυση των σημαντικότερων
προβλημάτων φυτοϋγείας στην παραγωγή πολλαπλασιαστικού υλικού οπωροφόρων δένδρων
κάνοντας χρήση των πλέον σύγχρονων εξελίξεων στη βιοτεχνολογία, προβλέπονται η διερεύνηση της
αιτιολογίας νέων και σημαντικών ασθενειών σε φυτώρια και οπωρώνες, η ανάπτυξη καινοτόμων
μεθόδων ταυτόχρονου ελέγχου της φυτοϋγείας του παραγόμενου υλικού και η προώθηση της
αντιμετώπισης των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών με βιοτεχνολογικές μεθόδους. Το 2014
πραγματοποιήθηκαν οι παρακάτω εργασίες:
Α. Ανάπτυξη της καινοτόμου Multiplex Real time RT-PCR για ταυτόχρονη ανίχνευση ιών, ιοειδών
και φυτοπλασμάτων σε δείγματα μηλοειδών. Έγινε ανάπτυξη δύο πρωτοκόλλων πολλαπλής
ανίχνευσης των παθογόνων. Με το πρώτο πρωτόκολλο εξετάζεται ταυτόχρονα στο ίδιο δείγμα η
παρουσία των ιοειδών
Pear blister canker viroid
(PBCVd),
Apple scar skin viroid
(ASSVd) και των
φυτοπλασμάτων (‘
Ca
. Phytoplasma mali’, και ‘
Ca.
Phytoplasma pyri’). Έγινε έλεγχος της εξειδίκευσης
των εκκινητών και ιχνηλατών, βελτιστοποίηση των παραμέτρων της αντίδρασης και προσδιορισμός
των ορίων ανίχνευσης της μεθόδου. Η εξειδίκευση των εκκινητών-ιχνηλατών ελέγχθηκε με δοκιμές σε
απομονώσεις αναφοράς και ακολούθησε βελτιστοποίηση των συνθηκών της αντίδρασης για επίτευξη
ταυτόχρονης ανίχνευσης των RNA και DNA στόχων στον ίδιο μικροσωλήνα. Τα όρια ανίχνευσης της
μεθόδου προσδιορίστηκαν με τη χρήση μεταγραμμένου RNA για τα ιοειδή και πλασμιδιακού DNA για
το φυτόπλασμα και πραγματοποιήθηκε σύγκριση με δημοσιευμένες συμβατικές μεθόδους ανίχνευσης
για το κάθε παθογόνο. Ταυτόχρονη και αποτελεσματική ανίχνευση των τριών, ταξονομικά
διαφορετικών παθογόνων επετεύχθη με την εφαρμογή της μεθόδου που αναπτύχθηκε σε αυτή τη
μελέτη, και η ευαισθησία της ανίχνευσης ήταν τουλάχιστον 10 φορές μεγαλύτερη εκείνης που
προέκυψε από την εφαρμογή των συμβατικών πρωτοκόλλων RT-PCR και PCR (Πίνακας 2.2.1.)
Με το δεύτερο πρωτόκολλο ελέγχεται στο ίδιο δείγμα η παρουσία των ιών
Apple chlorotic leaf
spot virus
(ACLSV),
Apple mosaic virus
(ApMV),
Apple stem grooving virus
(ASGV) και
Apple stem
pitting
virus (ASPV). Η ανάπτυξη του πρωτοκόλλου βρίσκεται στο στάδιο της αξιολόγησης των
εκκινητών και ιχνηλατών που σχεδιάστηκαν, ενώ έγιναν οι πρώτες δοκιμές για τετραπλή ταυτόχρονη
ανίχνευση των ιών σε μία αντίδραση. Αναμένεται ότι οι παραπάνω μέθοδοι θα είναι ιδανικές για
μαζικές αναλύσεις δειγμάτων ρουτίνας και θα διευκολύνουν κατά πολύ τις διαδικασίες πιστοποίησης
εξασφαλίζοντας εξαιρετικά μεγάλη ευαισθησία, ταχύτητα και αξιοπιστία.
Πίνακας 2.2.1.
Όρια ανίχνευσης των ιοειδών και φυτοπλασμάτων των μηλοειδών με χρήση της πολλαπλής RT-
qPCR που αναπτύχθηκε στα πλαίσια του προγράμματος και με συμβατικές RT-PCR/PCR.
Παθογόνο
Δεκαδικές αραιώσεις των ολικών νουκλεϊκών οξέων
Αριθμός αντιγράφων
Πολλαπλή RT-qPCR
Συμβατική RT-PCR ή
PCR
Πολλαπλή RT-qPCR
PBCVd
10
-3
10
-2
10
3
ASSVd
10
-5
10
-3
10
4
‘
Ca
. Phytoplasma mali’
10
-4
10
-3
10
4
‘
Ca
. Phytoplasma pyri’
10
-5
10
-4
Β. Εξυγίανση αχλαδιάς ποικ. Κοντούλα από το ιοειδές PBCVd. Έγινε δοκιμή μιας σύγχρονης τεχνικής
εξυγίανσης, της κρυοθεραπέιας βλαστοκορυφών, που εφαρμόζεται με επιτυχία στην εξυγίανση φυτών από
