53
πραγματοποιήθηκαν φυλογενετικές αναλύσεις για επιλεγμένα γονίδια των εκκριτικών συστημάτων ΙΙΙ και VI
στα παθογόνα
Erwinia amylovora
,
Pseudomonas syringae
pv.
syringae, Pseudomonas syringae
pv.
morsprunorum
και
Χanthomonas arboricola
pv.
pruni
με βάση προηγούμενες φυλογενετικές αναλύσεις των
γονιδίων που δομούν και ρυθμίζουν τη λειτουργία του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ (Guttman et al,
2006) και VI (Sarris et el. 2010). Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε ήταν η Neighbour-Joining, παραμέτρους
Nucleotide: Maximum Composite Likelihood, Pairwise deletion και με τη στήριξη αυτοδύναμης ανάλυσης
1000 δένδρων (μεθόδος Bootstrap) με το πρόγραμμα MEGA 4 (Tamura et al. 2007). Με βάση την
ανάλυση επιλέχθηκε το εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ προς χρήση. Οι hrp δέσμες γονιδίων του συστήματος
αυτού των φυτοπαθογόνων βακτηρίων χωρίζονται σε δύο κατηγορίες με βάση τη συντήρηση των
αλληλουχιών: στην ομάδα Ι ανήκουν τα
E. amylovora
και
P. syringae
και στην ομάδα ΙΙ οι παθότυποι του
X.
arboricola
. Για τον καλύτερο σχεδιασμό πραγματοποιήθηκε η ανεύρεση και συναρμολόγηση της
συστοιχίας γονιδίων hrp (27 Κb περίπου) από 100 περίπου φυτοπαθογόνα και επιφυτικά βακτηριακά
στελέχη. Οι αλληλουχίες ταξινομήθηκαν σε τέσσερις διακριτές ομάδες φυτοπαθογόνων βακτηρίων: α)
Pseudomonads, β) Xanthomonads, γ) Dickeya/Pectobacterium/ Erwinias και δ) Burkholderia/Ralstonia. Εν
συνεχεία, συστοιχήθηκαν με το πρόγραμμα ClustalW και βελτιστοποιήθηκαν μετά από προσεκτική
παρατήρηση κα αντιστοίχηση των περιοχών κωδικοποίησης. Ακολούθησε Bayesian φυλογενετική
ανάλυση για κάθε ομάδα. Με βάση τα φυλογενετικά πρότυπα που ανακτήθηκαν και με τη βοήθεια του
λογισμικού που αναπτυχθηκε στην πλατφόρμα προγραμματισμού R πραγματοποιήθηκε εκτενής και
επισταμένη μελέτη για την επιλογή των κατάλληλων περιοχών της συστοιχίας hrp. Οι περιοχές αυτές
χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ανιχνευτών που έχουν την ιδιότητα να ταυτοποιούν τα βακτηριακά
στελέχη έπειτα από εφαρμογή υβριδοποίησης σε πλακίδια μικροσυστοιχιών. Οι ανιχνευτές αυτοί έχουν
αξιολογηθεί με τη χρήση κατάλληλου λογισμικού.
Στην παρούσα φάση, οι επιλεγμένοι ανιχνευτές θα ακινητοποιηθούν σε κατάλληλα πλακίδια και
θα δοκιμαστούν με την υβριδοποίηση μορίων – στόχων από τουλάχιστο δέκα διαφορετικά παθογόνα.
Τα μόρια στόχοι είτε θα χρησιμοποιηθούν
per se
έπειτα από εκχύλιση ολικού DNA, είτε θα ενισχυθούν
με τη χρήση πρωτοκόλλων για multiplex PCR, τα οποία βρίσκονται υπό ανάπτυξη. Ταυτόχρονα,
καθαρές καλλιέργειες/απομονώσεις των επιλεγμένων παθογόνων συγκεντρώθηκαν από τη συλλογή
παθογόνων του ΜΦΙ και από δειγματοληψίες που πραγματοποιήθηκαν στα πλαίσια της
προηγούμενης ενότητας εργασιών και ακολούθησε εκχύλιση ολικού DNA σύμφωνα με τη μέθοδο των
Murray and Thompson (1980). Συνοψίζοντας, η ανάπτυξη των πρωτοκόλλων μεθοδολογίας βρίσκεται
σε πλήρη εξέλιξη και η ανάπτυξη και χρήση του πλακιδίου προγραμματίζεται για τους επόμενους
μήνες σε συνεργασία με το ΙΜΒΒ.
Σ
ΥΝΤΟΝΙΣΤΗΣ
Καθ. Ν. Κατής
Δ
ΙΑΡΚΕΙΑ
Ε
ΡΓΟΥ
24.1.2012 - 23.1.2015
Ε
ΜΠΛΕΚΟΜΕΝΟ
Π
ΡΟΣΩΠΙΚΟ
Δρ. Χ.Βαρβέρη, Δρ Ν. Βασιλάκος, Δρ Ν. Σκανδάλης,
Δρ Μ. Χολέβα, I. Μαλανδράκη Χ. Καράφλα, Π.Ε. Γλυνός,
Σ. Δρακούλης
Σ
ΧΕΤΙΚΗ
Ε
ΝΟΤΗΤΑ
“Π
ΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ
”
2.1.3
2.2.2 Ταυτοποίηση στελεχών Ωομυκήτων του γένους
Phytophthora
με κλασικές και
μοριακές μεθόδους
Ο χαρακτηρισμός και η ταυτοποίηση των στελεχών των Ωομυκήτων του γένους
Phytophthora,
τόσο εκείνων που περιλαμβάνονται ήδη στην επίσημη Συλλογή μικροοργανισμών του Ινστιτούτου όσο
και εκείνων που απομονώνονται από ασθενή δείγματα φυτών στο πλαίσιο της διαγνωστικής
υπηρεσίας που παρέχει το Ινστιτούτο, βασίζεται κυρίως στους καλλιεργητικούς και μορφομετρικούς
χαρακτήρες των στελεχών και σε μερικές περιπτώσεις και στον έλεγχο, μέσω της διενέργειας
βιοδοκιμών, της παθογένειάς τους στους αντίστοιχους ξενιστές. Το Εργαστήριο Μυκητολογίας
