52 ΜΦΙ
Έκθεση Εργασιών Έτους 2016
Παράρτημα Β
53
Τμήμα Φυτοπαθολογίας
Α. ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ ΧΡΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ ΜΦΙ
Α/Α Διάρκεια
α. Τίτλος, β. Σκοπός, γ. Εκτελεσθείσα εργασία το έτος 2016
1
4 έτη
(1.1.2015-1.12.2018)
α.
Ανάπτυξη διαγνωστικών πρωτοκόλλων για τη μοριακή ανίχνευση ιών σε επίπεδο γένους
β.
Σκοπός του έργου είναι η ανάπτυξη και αξιολόγηση πρωτοκόλλων για την ταχεία μοριακή
ανίχνευση σημαντικών ιών των κηπευτικών και δενδρωδών καλλιεργειών σε επίπεδο γέ-
νους. Η χρησιμοποίηση τέτοιων πρωτοκόλλων αναμένεται να αναβαθμίσει ριζικά την ποιό-
τητα και αξιοπιστία των διαγνωστικών δυνατοτήτων του Εργαστηρίου Ioλογίας.
γ.
Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές που οδήγησαν στην εφαρμογή του πρωτοκόλλου RT-qPCR
με χρήση Taqman ιχνηλάτη, που προτείνει η International Seed Federation (ISF) για την
ανίχνευση του ιοειδούς των ατρακτοειδών κονδύλων της πατάτας σε σπόρους τομάτας και
πιπεριάς (
Potato spindle tuber viroid
, PSTVd). Το πρωτόκολλο βασίζεται σε εκείνο του ολ-
λανδικού οργανισμού NAKTUINBOUW [REFERENCE PROTOCOL NAKTUINBOUW Real-time
RT-PCR (RT TaqMan PCR) for pospiviroids (CEVd, CLVd, MPVd, PCFVd, PSTVd, TASVd, TCDVd
and TPMVd) on seeds of pepper (
Capsicum annuum
) and tomato (
Solanum lycopersicum
)].
2
Διαρκής
Δραστηριότητα
α.
Μελέτη νεοεμφανιζόμενων ιώσεων και ανάπτυξη σύγχρονων μεθόδων ανίχνευσης των συ-
σχετιζόμενων στελεχών και ιών.
β.
Ταυτοποίηση, βιολογικός και μοριακός χαρακτηρισμός νεοεμφανιζόμενων ιών και στελε-
χών γνωστών ιών που προκαλούν νέες ασθένειες. Ανάπτυξη πρωτόκολλων ταχείας ανί-
χνευσης τους.
γ.
Σε δείγμα ροδιάς με συμπτώματα χλωρώσεων και μικροφυλλίας από φυτώριο της περιοχής
του Ναυπλίου έγινε ανίχνευση με την ανοσολογική δοκιμή ELISA του σχετιζόμενου ιού με το
καρούλιασμα των φύλλων της αμπέλου-1 (
Grapevine leafroll-associated virus-1
, GLRaV-1), ο
οποίος για πρώτηφορά αναφέρθηκε διεθνώς ότι μπορεί εκτός από το αμπέλι να προσβάλλει
τη ροδιά το 2015. Ο έλεγχος για άλλα παθογόνα της ροδιάς όπως ο ιός του μωσαϊκού της αγ-
γουριάς και το ιοειδές του νανισμού του λυκίσκου, με τημέθοδο ELISAκαι RT-PCR αντίστοιχα,
ήταν αρνητικός. Εξέταση περισσοτέρων δειγμάτων από την ίδια επιχείρηση έδειξε την πα-
ρουσία του ιού και σε άλλα συμπτωματικά και μη συμπτωματικά δείγματα ροδιάς, γεγονός
πουδείχνει ότι ο ιόςδενμπορεί νασυσχετισθεί μεσυγκεκριμένασυμπτώματα. Ηπροσπάθεια
επιβεβαίωσης της παρουσίας του ιού με μοριακή δοκιμή RT-PCR και δημοσιευμένους εκκι-
νητές δεν ήταν δυνατή και για αυτό το λόγο σχεδιάστηκαν νέοι που βρίσκονται υπό δοκιμή.
Ο ιός της ποικιλίας Pinot gris της αμπέλου (
Grapevine Pinot gris virus
, GPGV) είναι ένας νέος
ιός που προκαλλεί σε κάποιες ποικιλίες αμπέλου χλώρωση και παραμόρφωση φύλλων.
Tαυτοποιήθηκε για πρώτη φορά στην Ιταλία το 2012 και αναφέρθηκε για πρώτη φορά η
παρουσία του στη χώρα μας το 2014. Η εφαρμογή δημοσιευμένων μοριακών πρωτοκόλλων
ανίχνευσης του ιού σε θετικούς μάρτυρες είχε διαφορετική αποτελεσματικότητα και τελικά
έγινε η επιλογή του πρωτοκόλλου των Glasa et al. (2014) καθώς και η επιτυχής ανίχνευση
του ιού σε φυτωριακά δείγματα.
3
2 έτη
(2016-2017)
α.
The application of Next-Generation Sequencing technology for the detection and diagno-
sis of non-culturable organisms: viruses and viroids (2015-F-172) (Έργο διενεργούμενο στο
πλαίσιο του Δικτύου Euphresco των Κρατών-μελών της Ε.Ε. και του EPPO)
β.
Σκοπός του έργου είναι η ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων αλληλούχησης νέας γενιάς για
την ανίχνευση ιών και ιοειδών.
γ.
Έγινε έλεγχος του ιικού φορτίου κλώνου ποικιλίας «Μοσχοφίλερο» αρχικού υλικού αμπέ-
λου, υπό ένταξη σε πρόγραμμα παραγωγής υγιούς πολλαπλασιασιστικού υλικού, με την
τεχνολογία της αλληλούχησης νέας γενιάς (Νext Generation Sequencing, NGS). Η νέα αυτή
τεχνολογία που αναπτύχθηκε μόλις τα τελευταία 10 χρόνια και έχει βρει εφαρμογή και στην
ιολογία φυτών από το 2009 αποτελεί το μοναδικό τρόπο προσδιορισμού του συνόλου ιι-
κών γονιδιωματικών αλληλουχιών (virome) σε ένα δείγμα. Έγινε αρχικά απομόνωση μικρών
RNA από το δείγμα αμπέλου με τη βοήθεια εξειδικευμένων εμπορικών συστημάτων και στη
συνέχεια στάλθηκε το δείγμα για ανάλυση σε πλατφόρμα εταιρείας του εξωτερικού
Α/Α Διάρκεια
α. Τίτλος, β. Σκοπός, γ. Εκτελεσθείσα εργασία το έτος 2016
Η βιοπληροφορική ανάλυση των ψηφιακών δεδομένων που μας στάλθηκαν έγινε με εξειδι-
κευμένα προγράμματα (Velvet, AssemblyAssembler, maq, FAstQC, Tablet). Τα αποτελέσμα-
τα επαληθεύθηκαν και με πιο εξειδικευμένα προγράμματα όπως το VirusDetect.
Το αρχικό υλικό της αμπέλου που εξετάσθηκε βρέθηκε απαλλαγμένο από τους ιούς που
προβλέπονται στην ευρωπαϊκή και εθνική νομοθεσία και που αφορά στην κλωνική επιλογή
αμπέλου και στην πιστοποίηση πολλαπλασιαστικού υλικού. Διαπιστώθηκε όμως η παρου-
σία των
Grapevine rupestris vein feathering virus
(GRVFV) και
Grapevine redglobe virus
(GRGV)
και η βιοπληροφορική ανάλυση επέτρεψε μερική συγκρότηση της γονιδιωματικής αλλη-
λουχίας τους. Ταυτόχρονα ανιχθεύθηκαν τα ιοειδή
Grapevine yellow speckle viroid-1
(type
2) (GYSVd-1) και
Hop stunt viroid
(HSVd) για τα οποία ανακτήθηκε η πλήρης νουκλεοτιδική
αλληλουχία. Η επιβεβαίωση της παρουσίας των δυο νέων ιών στο δείγμα με άλλες μορια-
κές μεθόδους είναι σε εξέλιξη.
4
2 έτη
(1.1.2016-1.12.2017)
α.
Διερεύνηση των γενετικών παραγόντων της πιπεριάς (
Capsicum annuum
) που καθορίζουν
τη συμβατότητα μόλυνσης με τον ιό Υ της πατάτας (
Potato virus Y
, PVY)
β.
Προσδιορισμός α) του τρόπου δράσης των πρωτεϊνών P3 και P3N-PIPO του PVY στη συμβα-
τότητα του ιού με το φυτό ξενιστή πιπεριά και β) του ρόλου συγκεκριμένων πρωτεϊνών της
πιπεριάς που αλληλοεπιδρούν με τις παραπάνω ιϊκές πρωτεΐνες στο πολλαπλασιασμό και
τη διακυτταρική μετακίνηση του PVY κατά τα αρχικά στάδια της μόλυνσης
γ.
Για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων που πιθανώς καθορίζουν την προσαρμοστικότητα του
PVY στην πιπεριά εντοπίστηκαν ορθόλογες πρωτεΐνες της πιπεριάς, για τις οποίες σε άλλους
ξενιστές έχει δειχθεί ότι αλληλοεπιδρούν με την P3NPIPO και καθορίζουν τη διασυστημι-
κή μετακίνηση ιών του γένους
Potyvirus
. Συγκεκριμένα, ενισχύθηκε και αλληλουχήθηκε η
PCaP1 (Plasma membrane Cation binding Protein 1) πρωτεΐνη, η οποία στο παθοσύστημα
αραβίδοψη-
Turnip mosaic virus
(TuMV, γένος
Potyvirus
) σχετίζεται με τη διακυτταρική με-
τακίνηση του ιού. Για τη διερεύνηση του πιθανού ρόλου της πρωτεΐνης αυτής στη συγκέ-
ντρωση και μετακίνηση του PVY στην πιπεριά χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της γονιδιακής
σίγησης επαγόμενης από ιό (Virus Induced Gene Silencing, VIGS), ενώ ο τρόπος δράσης
της μελετήθηκε τόσο σε επίπεδο φυτού όσο και κυττάρου. Η τελευταία αυτή μελέτη πραγ-
ματοποιήθηκε μετά την ανάπτυξη αποτελεσματικού πρωτοκόλλου απομόνωσης πρωτο-
πλαστών πιπεριάς. Τα αποτελέσματα των δύο πειραματικών προσεγγίσεων απέδειξαν την
εμπλοκή της πρωτεΐνης στη διασυστηματική μετακίνηση του PVY στην πιπεριά. Επιπλέον,
σε διαφοροποίηση από το παθοσύστημα αραβίδοψη-TuMV, η PCaP1 της πιπεριάς επηρεά-
ζει τον πολλαπλασιασμό του PVY σε κυτταρικό επίπεδο.
5
1 έτος
(1.1.2016-1.12.2016)
α.
Διερεύνηση της δράσης βιολογικών παραγόντων στην επαγωγή ανθεκτικότητας φυτών το-
μάτας έναντι φυτικών ιών.
β.
Διερεύνηση της δράσης ριζοβακτηρίου στην επαγωγή ανθεκτικότητας φυτών τομάτας
έναντι φυτικών ιών.
γ
.
Σε συνεργασία με το Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών
(Επικ. Καθ. Σ. Τζάμος) πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικά πειράματα για πιθανή αντιϊική
δράση του βιολογικού παράγοντα
Paenibacillus alvei
K165, έναντι του ιού του μωσαϊκού της
αγγουριάς (
Cucumber mosaic virus
, CMV) και του ιού του κηλιδωτού μαρασμού της τομάτας
(
Tomato spottedwilt virus
, TSWV) στη τομάτα. Τα πειράματα έδειξαν καμία δράση έναντι του
CMV αλλά πιθανή δράση έναντι του TSWV.
6
2 έτη
α.
Consensus detection protocol for
Acidovorax citrulli
on Cucurbit seeds (2015-D-142) (το
έργο θα διενεργηθεί στο πλαίσιο του Δικτύου Euphresco των Κρατών-μελών της Ε.Ε. και
του EPPO).
β.
Σκοπός του έργου είναι η ανάπτυξη νέων ή η βελτιστοποίηση των υπαρχουσών μεθόδων
ανίχνευσης και ταυτοποίησης του φυτοπαθογόνου βακτηρίου
Acidovorax citrulli
σε σπό-
ρους κολοκυνθοειδών, καθώς και η συγκριτική αξιολόγησή τους για τη διαμόρφωση σχετι-
κού διαγνωστικού πρωτοκόλλου.
γ.
Το συγκεκριμένο Ευρωπαϊκό πρόγραμμα EUPHRESCO αφορά σε δίκτυο με αντικείμενο την
ανάπτυξη ενός διαγνωστικoύ πρωτοκόλλου για το φυτοπαθογόνο βακτήριο
Acidovorax
citrulli
(Ac) που προκαλεί τη σοβαρή ασθένεια ‘Βακτηριακή κηλίδωση των καρπών’ στα κο-
λοκυνθοειδή. Το βακτήριο προσβάλλει κυρίως τις καλλιέργειες καρπουζιάς και πεπονιάς
προκαλώντας σημαντική οικονομική ζημία στην παραγωγή. Στη χώρα μας, η ασθένεια
