Page 101 - 2010-2011

100
παθογόνου-ξενιστού), για να καταστείλουν μηχανισμούς άμυνας των ξενιστών τους. Η μεταφορά των
effectors γίνεται μέσω ενός εξειδικευμένου αγωγού μεταφοράς πρωτεϊνών που ονομάζεται εκκριτικό
κανάλι τύπου ΙΙΙ (TTSS). Τα κανάλι αυτό δομείται από περίπου 25 πρωτεΐνες και είναι εξελικτικά
συντηρημένο σε gram- παθογόνα βακτήρια φυτών θηλαστικών και εντόμων (Alfano και Collmer,
1997). Οι µικροσυστοιχίες, αποτελούν µία σχετικά νέα τεχνολογία υψηλού ρυθμού απόδοσης που
έχει επιδράσει θεμελιωδώς στην βιολογική έρευνα, καθώς βρίσκει εφαρμογή στην ταυτόχρονη
ανάλυση πολλών γονιδίων & αλληλουχιών, σε επίπεδο γονιδιωµάτων και πληθυσμών. Επιτρέπει
έτσι την εκτέλεση χιλιάδων παράλληλων αναλύσεων, στην επιφάνεια ενός µόνο chip, που
περικλείει µικροσυστοιχίες χιλιάδων δειγμάτων. Ανερχόμενοι τομείς εφαρμογής είναι αυτοί της
διαγνωστικής, εξατοµικευµένης ιατρικής, καθώς και περιβαλλοντικής/ οικοτοξικολογικής ανάλυσης
και της αγρο-βιοµηχανικής ανάλυσης (Aittamaa et al., 2008). Η αναφερόμενη ερευνητική ομάδα,
αξιοποιώντας τόσο τις συντηρημένες περιοχές των γονιδίων του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ, όσο
και περιοχές τους που παρoυσιάζουν πολυμορφισμό, έχει κατασκευάσει ένα διαγνωστικό πλακίδιο
μικροσυστοιχιών που θα επιτρέπει –σε πρώτη φάση- την γρήγορη ανίχνευση των κυριοτέρων
φυτοπαθογόνων βακτηρίων κηπευτικών κυρίως καλλιεργειών. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης έγινε
ανάπτυξη πρωτοκόλλων για ανίχνευση από ιστό φυσικά/τεχνητά μολυσμένων φυτών στο Μ.Φ.Ι. με τη
χρήση του συγκεκριμένου πλακιδίου στις υποδομές του Ινστιτούτου Μοριακής Βιολογίας και
Βιοτεχνολογίας.
Με βάση προηγούμενες φυλογενετικές αναλύσεις των γονιδίων που δομούν και ρυθμίζουν τη
λειτουργία του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ (Guttman et al, 2006) επιλέχθηκαν συγκεκριμένα
γονίδια που δομούν το σύστημα και παρουσιάζουν συντηρημένες περιοχές νουκλεοτιδίων, μεταξύ των
οποίων περικλείονται περιοχές νουκλεοτιδίων με υψηλό βαθμό πολυμορφισμού. Για το σχεδιασμό των
ολιγονουκλεοτιδίων-ιχνηλατών αναλύθηκε το σύνολο των διαθεσιμων αλληλουχιών, για τα επιλεγμένα
γονίδια, σε βάσεις δεδομένων γονιδιακών τραπεζών όπως η NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )με τη
χρήση του αλγόριθμου BLAST και των εργαλείων Sequence Match και Classifier αντίστοιχα, ώστε να
βρεθούν οι μικροοργανισμοί που παρουσιάζουν μεγαλύτερη ταυτότητα αλληλουχίας με βάση την
νουκλεοτιδική τους αλληλουχία. Το σύνολο των αλληλουχιών συγκρίθηκε σε πρώτη φάση με τη
βοήθεια του λογισμικού BioEdit. (31/05/05 Hall, 1999) και στοιχήθηκε με τη βοήθεια του λογισμικού
ClustalW (Thompson et al., 1994). Ο σχεδιασμός των ολιγονουκλεοτιδίων πραγματοποιήθηκε με την
εφαρμογή του προγράμματος βιοπληροφορικής OligoArray 2.1 (Rouillard et al., 2003) στο σύνολο των
διαθέσιμων αλληλουχιών για κάθε γονίδιο, για να αυξήσει την εξειδίκευση-ευαισθησία του ιχνηλάτη-
στόχου. Εκτυπώθηκαν σε πρώτη φάση περί τις 80 κουκίδες μονόκλωνων αλληλουχιών DNA τα οποία
δρουν σαν μια μικρή συστοιχία κολλητικών επιφανειών που προσελκύουν τα συμπληρωματικά μόρια
DNA που ενισχύθηκαν με PCR και εφαρμόστηκαν σε υγρή μορφή για υβριδοποίηση πάνω στα
πλακίδια. Για τη συλλογή των κυριοτέρων φυτοπαθογόνων βακτήρίων χρησιμοποιηθηκαν οι κλασικές
μέθοδοι απομόνωσης από μολυσμένα καλλιεργούμενα είδη και από δευτερεύοντες ξενιστές-ζιζάνια.
Για την απομόνωση του γενομικού DNA αυτών χρησιμοποιηθηκε η μέθοδος των Murray M. G. και
Thompson (1980), καθώς και νέες μέθοδοι ταχείας απομόνωσης DNA (Wattman). Για την ενίσχυση
των συντηρημένων περιοχών που περικλείουν τις περιοχές με υψηλό βαθμό πολυμορφισμού έχουν
ήδη σχεδιαστεί διαφορετικά ζεύγη εκκινητών με διαφορετικό βαθμό εκφυλισμού. Οι περιοχές μεταξύ
των σημασμένων (Cy3, Cy5) εκκινητών θα ενισχυθούν με PCR σε διαβαθμιζόμενη θερμοκρασία
(gradient PCR), τα πρωτόκολλα θα αξιολογήθηκαν επιλέχθηκε αυτό που απέφερε την μεγαλύτερη
ποσότητα της επιθυμητής «ζώνης» του προιόντος σε πηκτωμα αγαρόζης σε συνδυασμό με τη
μικρότερη ενίσχυση σε εσφαλμένες περιοχές του γονιδιώματος. Η υβριδοποίηση πραγματοποιήθηκε
σε ειδικό μηχάνημα το οποίο καλείται σταθμός υβριδοποίησης (hybridization station, HS4800) της
εταιρίας Tecan.
Με το πέρας της υβριδοποίησης η επιφάνεια των μικροσυστοιχιών σαρώνεται με τη βοήθεια
της συσκευής σάρωσης (scanner) ScanArray5000 (GSI Lumonics, Wilmington, MA). Οι εικόνες που
λαμβάνονται με τη σάρωση αποθηκεύονται με την μορφή 16-bit TIFF file. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια
κατάλληλου λογισμικού οι εικόνες αυτές προβάλλονται η μια πάνω στην άλλη και επεξεργάζονται με
σκοπό την απομάκρυνση των ακατάλληλων spots.