Page 57 - ektheseis 2012

55
2.2.8 Χαρακτηρισμός νέων απομονώσεων του ιού της τριστέτσας των
εσπεριδοειδών – Πρόγραμμα BPI-Plant Heal (FP7-REGPOT-2008-1, No230010)
Ο πληθυσμός βραχέων παρεμβαλλόμενων RNA (siRNAs), που παράγεται από τη δράση
πρωτεϊνών τύπου Dicer επί των εμφανιζόμενων δίκλωνων RΝΑ (dsRNAs) κατά τα αρχικά στάδια του
πολλαπλασιασμού των ιών μέσα στα φυτά, μπορεί να αλληλουχηθεί από την τεχνολογία
αλληλούχησης νέας γενιάς Ion Torrent. Η στρατηγική αυτή χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση
δείγματος προερχόμενου από δένδρο λεμονιάς από το Λεμονοδάσος Πόρου Τροιζηνίας, στο οποίο
είχε ανιχνευθεί ο ιός της τριστέτσας των εσπεριδοειδών (Citrus tristeza virus, CTV). Αρχικά έγινε
μετάδοση του μολύσματος με εμβολιασμό σποροφύτων πορτοκαλιάς cv. Madam Vinous και στη
συνέχεια απομόνωση των siRNAs. Η πλατφόρμα Ion Torrent έκανε δυνατό τον προσδιορισμό 432.632
αλληλουχιών. Η βιο-πληροφορική de novo ανάλυση επιβεβαίωσε την παρουσία του CTV
διαπιστώνοντας την ύπαρξη πολλαπλών αλληλο-επικαλυπτόμενων αλληλουχιών (contigs) του ιού. Οι
αλληλουχίες των siRNAs της απομόνωσης του CTV στο δείγμα χαρτογραφήθηκαν με γνωστές
αλληλουχίες διαφόρων απομονώσεων αναφοράς του ιού με αποτέλεσμα τη συναρμολόγηση
ολοκλήρου του γονιδιώματος, 19.251 νουκλεοτιδίων, της συγκεκριμένης απομόνωσης L192GR του
CTV. Η φυλογενετική ανάλυση της απομόνωσης L192GR έδειξε υψηλή μοριακή συγγένεια με την
απομόνωση VT από το Ισραήλ (GenBank Acc. No EU937519.1) με 98% γενετική ομοιότητα. Τα
αποτελέσματα αυτά δείχνουν τη μεγάλη δυναμική αυτής της πλατφόρμας αλληλούχησης νέας γενιάς
που ανοίγει καινούργιους ορίζοντες στον χαρακτηρισμό φυτοπαθογόνων οργανισμών.
Η ανωτέρω εργασία έγινε με τη συνεργασία ερευνητών του Ιnstituto Valenciano de
Investigaciones Agrarias (IVIA), Valencia, Ισπανία στα πλαίσια μετακινήσεων της Δρ Χ. Βαρβέρη και
του Dr Antonio Olmos στο IVIA και ΜΦΙ, αντίστοιχα, με το Πρόγραμμα «Development of Benaki
Phytopathological Institute as a Centre of Excellence in plant health and Crop protection»
(FP7-REGPOT-2008-1, No230010).
2.2.9 Μελέτη νεοεμφανιζόμενων ιών σε οικονομικής σημασίας καλλιέργειες και
ανάπτυξη σύγχρονων μεθόδων ανίχνευσής τους
Εγινε ιολογικός έλεγχος σε δείγματα φυτών ντάλιας (Dahlia variabilis, ποικιλία Tutu) που
παρουσίαζαν συμπτώματα καχεξίας, κοντά μεσογονάτια διαστήματα και σοβαρές παραμορφώσεις
των φύλλων σε ποσοστό 40% των φυτών επιχείρησης από την περιοχή του Μαραθώνα με έκταση ~5
στρ. Αρχικά πραγματοποιήθηκε έλεγχος για τον Cucumber mosaic virus με την μέθοδο ELISA, ο
οποίος ήταν αρνητικός. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν τεχνητές μολύνσεις σε φυτά δείκτες
(Nicotianna tabacum (cv. Samsun 53, cv. Glurk, cv. Turk), Nicotiana glutinosa, Nicotiana clevelandii,
Chenopodium quinoa) στο θερμοκήπιο του εργαστηρίου. Στους δείκτες C. quinoa και N. tabacum cv.
Samsun 53 παρατηρήθηκαν κίτρινα στίγματα και νεκρωτικές κηλίδες αντίστοιχα. Στη συνέχεια
πραγματοποιήθηκε εξαγωγή του ολικού DNA από τους ιστούς των δειγμάτων με την τροποποιημένη
μέθοδο των Dellaporta et al. (1983) και PCR με τους εξειδικευμένους εκκινητές των Pappu et al.
(2005) για τον ιό Dahlia mosaic virus (DMV, γένος Rhabdoviridae ) και προέκυψε η ενίσχυση ενός
προιόντος DNA περίπου 500 ζευγών βάσεων νουκλεοτιδίων. Ακολούθησε αλληλούχηση του
ΤΜΗΜΑ Φυτοπαθολογίας
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Ιολογίας
ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΕΡΓΟΥ Δρ Χ. Βαρβέρη
ΕΜΠΛΕΚΟΜΕΝΟ ΠΡΟΣΩΠΙΚΟ Δρ Ν. Βασιλάκος
ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΕΡΓΟΥ 2.1.09 - 31.8.2013
ΠΗΓΗ ΧΡΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ ΜΦΙ/BPI-Plant Heal