36
2.3 Μελέτη των φυτοπαθογόνων οργανισμών, των μη παρασιτικών παθή-
σεων, των διαδικασιών παθογένεσης καθώς και των μηχανισμών άμυνας
των φυτών
2.3.1 Βελτιστοποίηση της παραγωγής υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού οπωρο-
φόρων δένδρων με σύγχρονες βιολογικές και βιοτεχνολογικές μεθόδους
(ΒΙΟΚΑΡΠΟΣ)
Το πρόγραμμα ΒΙΟΚΑΡΠΟΣ αποσκοπούσε στη μελέτη και επίλυση των σημαντικότερων
προβλημάτων φυτοϋγείας στην παραγωγή πολλαπλασιαστικού υλικού οπωροφόρων δένδρων
κάνοντας χρήση των πλέον σύγχρονων εξελίξεων στη βιοτεχνολογία, μέσω της διερεύνησης της
αιτιολογίας νέων και σημαντικών ασθενειών σε φυτώρια και οπωρώνες, της ανάπτυξης καινοτόμων
μεθόδων ταυτόχρονου ελέγχου της φυτοϋγείας του παραγόμενου υλικού και της προώθησης της
αντιμετώπισης των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών με βιοτεχνολογικές μεθόδους.
Το 2015 ολοκληρώθηκε το έργο και πραγματοποιήθηκαν οι παρακάτω εργασίες:
Α. Ανάπτυξη της καινοτόμου μεθόδου της πολλαπλής (multiplex) αντίστροφης μεταγραφής -
ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (RT-qPCR) για την ταυτόχρονη ανίχνευση
παθογόνων ιών γιγαρτοκάρπων. H μέθοδος αφορούσε στους
Apple mosaic virus
(ApMV),
Apple
stem grooving virus
(ASGV) και
Apple stem pitting
virus (ASPV). Σχεδιάστηκαν κατάλληλοι
μοριακοί εκκινητές και ιχνηλάτες για την εφαρμογή της RT-qPCR και υπολογίστηκαν τα όρια
ανίχνευσης της αντίδρασης, με την κατασκευή αντιγράφων μεταγραμμένου RNA των ιών. Η
διαδικασία πραγματοποιήθηκε ως εξής: τα προϊόντα συμβατικής RT-PCR που αντιστοιχούσαν σε
τμήμα του γονιδιώματος των ιών που περιελάμβανε την περιοχή όπου σχεδιάστηκαν οι εκκινητές-
ιχνηλάτης (στην περιοχή του γονιδιώματος που κωδικοποιεί την καψιδιακή πρωτεϊνη των ιών)
κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pCR®II-TOPO® TA vector (Invitrogen™). Οι αποκτηθέντες κλώνοι
αλληλουχήθηκαν για επιβεβαίωση και δημιουργήθηκαν τα αντίγραφα μεταγραμμένου RNA με
συνήθεις διαδικασίες. Ακολούθησε αλληλούχηση και απομόνωση του κλωνοποιημένου τμήματος
με ένζυμα περιορισμού, ηλεκτροφόρηση και καθαρισμός από το πήγμα αγαρόζης. Όλα τα
αντίγραφα που δημιουργήθηκαν, ποσοτικοποιήθηκαν με χρήση του NanoPhotometerTM P-Class
P330 (IMPLEN) (όργανο που αποκτήθηκε στα πλαίσια του παρόντος προγράμματος) και
υπολογίστηκε ο αριθμός των αντιγράφων ανά νανογραμμάριο. Πραγματο-ποιήθηκαν δεκαδικές
αραιώσεις των αντιγράφων, ελέγθηκε η ταυτόχρονη ανίχνευσή τους με το πρωτόκολλο της RT-
qPCR (Εικ. 1) και προσδιορίστηκαν τα όρια ανίχνευσης του πρωτοκόλλου που αναπτύχθηκε, τα
οποία φαίνονται αναλυτικά στον Πίνακα 1. Τα όρια αυτά συμπίπτουν με τα γνωστά από τη
βιβλιογραφία όρια ανίχνευσης της RT-qPCR για RNA ιούς και πιστοποιούν τη μεγάλη ευαισθησία
της μεθόδου.
Εικόνα 1.
Ταυτόχρονη ανίχνευση 10
6
αντιγράφων για κάθε έναν από τους ιούς
Apple stem pitting virus
(
ASPV),
Apple stem grooving virus
(
ASGV) και
Apple mosaic virus
(
ApMV) με RT-qPCR.
