37
Πίνακας 1:
Όρια ταυτόχρονης ανίχνευσης παθογόνων ιών των γιγαρτοκάρπων με το πρωτόκολλο RT-qPCR που
αναπτύχθηκε στα πλαίσια του παρόντος έργου.
Π
ΑΘΟΓΟΝΟ
Α
ΡΙΘΜΟΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΩΝ
ASPV
10
4
ASGV
10
5
ApMV
10
4
Β. Κατά το έτος 2015, το Εργαστήριο Βακτηριολογίας συνέχισε την επισκόπηση σε οπωρώνες
πυρηνοκάρπων και γιγαρτοκάρπων σε περιοχές της Χώρας συλλέγοντας δείγματα φυτικών ιστών για
τη διαπίστωση τυχόν παρουσίας σε αυτά φυτοπλασμάτων. Η επεξεργασία των δειγμάτων περιέλαβε
μοριακή ανίχνευση (nested PCR), προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των προϊόντων της
PCR, και σύγκριση των αποτελεσμάτων με αντίστοιχα δεδομένα από διεθνείς βάσεις κατατεθειμένων
νουκλεοτιδικών αλληλουχιών. Βάσει των αποτελεσμάτων έγινε εκτίμηση της συχνότητας της
παρουσίας των φυτοπλασμάτων στα καρποφόρα δένδρα. Συνολικά, συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν
383 δείγματα από 8 περιοχές της χώρας. Τα δείγματα αυτά βρέθηκαν μολυσμένα από φυτόπλασμα σε
ποσοστό 11,7%. Το
Ca.
Phytoplasma pyri ήταν το πιο διαδεδομένο στα γιγαρτάκαρπα με συχνότητα
εμφάνισης 7,5% ενώ το
Ca.
Phytoplasma mali δεν διαπιστώθηκε σε κανένα δείγμα. Κατά το 2015,
συγκρίθηκαν δυο πρωτόκολλα ανίχνευσης και ταυτοποίησης φυτοπλασμάτων: PCR μετά από
ανοσοδέσμευση και PCR μετά από εξαγωγή νουκλεϊνικών οξέων. Η τελευταία απεδείχθη πολύ πιο
ευαίσθητη καθώς ανίχνευσε την παρουσία φυτοπλάσματος σε διπλάσιο αριθμό δειγμάτων. Τέλος, η
φυλογενετική ανάλυση των αλληλουχιών που αποκτήθηκαν από τα PCR προϊόντα στην 16S rDNA
περιοχή επέτρεψε την κατασκευή δενδρογραμμάτων της γενετικής συγγένειας των ευρεθέντων
φυτοπλασμάτων.
Παράλληλα, ολοκληρώθηκαν οι πειραματικές εργασίες μελέτης του μοριακού μηχανισμού
παθογένεσης που διεγείρεται κατά την αλληλεπίδραση του παθογόνου βακτηρίου
Erwinia amylovora
με φυτά αχλαδιάς διαφορετικής ευπάθειας. Συγκεκριμένα, ολοκληρώθηκε η αξιολόγηση επτά ποικιλιών
αχλαδιάς ως προς την ευπάθειά τους στο εν λόγω παθογόνο. Τα φυτά διατηρούνταν εντός
θερμοκηπίου μετά την τεχνητή μόλυνσή τους με το παθογόνο
E. amylovora
. Οι ποικιλίες Κρυστάλι και
Coscia επιλέχθηκαν η μεν πρώτη ως ευπαθής και η δε δεύτερη ως μετρίως ανθεκτική ποικιλία στο
E.
amylovora
, και έγινε σύγκριση του μεταγραφικού προφίλ των μολυσμένων ιστών κατά τις πρώτες ώρες
της αλληλεπίδρασης. Για τη σύγκριση εφαρμόστηκε η μέθοδος του κατασταλτικού αφαιρετικού
υβριδισμού (suppression subtractive hybridization, SSH) επί βιβλιοθηκών cDNA από μολυσμένα
ευπαθή ή μετρίως ανθεκτικά φυτά και μη μολυσμένα φυτά, σε διάφορους συνδυασμούς. Συνολικά από
τη μέθοδο SSH προέκυψαν 1152 EST κλώνοι των οποίων η νουκλεοτιδική αλληλουχία
προσδιορίστηκε και συγκρίθηκε με αντίστοιχες κατατεθειμένες σε διεθνείς βάσεις δεδομένων. Με την
ως άνω μέθοδο, εντοπίστηκαν γονίδια με διαφορική έκφραση που πιθανόν εμπλέκονται στην
ανεκτικότητα/ευπάθεια στο
E. amylovora
και ομαδοποιήθηκαν σε ‘λειτουργικές’ κατηγορίες βάσει της
ομολογίας τους με γνωστά γονίδια. Τέλος, για τέσσερα επιλεγμένα γονίδια επιβεβαιώθηκαν τα
αποτελέσματα του κατασταλτικού αφαιρετικού υβριδισμού με qPCR.
Γ. Έγινε ανάπτυξη συστήματος μικροσυστοιχιών για ταυτόχρονη μοριακή ανίχνευση φυτοπαθογόνων
βακτηρίων με βάση τη νησίδα φυτοπαθογέγειας hrp που κωδικοποιεί για τα δομικά/ρυθμιστικά
στοιχεία του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ που είναι απαραίτητο για την εκδήλωση
παθογένειας. Πραγματοποιήθηκαν προκαταρτικές φυλογενετικές αναλύσεις για επιλεγμένα γονίδια
των εκκριτικών συστημάτων σε 6 μεγάλες ομάδες παθογόνων βακτηρίων (119 είδη ή παθότυποι).
Η ανάγνωση της κατανομής της γενετικής ποικιλομορφίας και των φυλογενετικών σχέσεων των
νησίδων hrp αποτέλεσαν οδηγό για την επιλογή των περιοχών για την κατασκευή των ανιχνευτών
(probes) των μικροσυστοιχιών. Πριν την πραγματοποίηση της υβριδοποίησης των δειγμάτων στο
πλακίδιο, επιτελέστηκε προσομοίωσή της σε ηλεκτρονικό υπολογιστή. Σύμφωνα με την
in silico
ανάλυση πραγματοποιήθηκε η κατασκευή διαγνωστικού πλακιδίου με βάση τη νησίδα hrp/hrc που
διαφοροποιεί με μεγάλη ακρίβεια φυτοπαθογόνα βακτήρια αποκλείοντας ή να ελαχιστοποιώντας
