ΕΚΘΕΣΗ ΕΡΓΑΣΙΩΝ ΕΤΟΥΣ 2015 - page 39

38
τις περιπτώσεις μη-ειδικής υβριδοποίησης ακόμα και έπειτα από φυσική μόλυνση. Επιπλέον,
όπως προκύπτει από την ανάλυση, το διαγνωστικό πλακίδιο θα μπορούσε να διακρίνει και
παθογόνα βακτήρια για τα οποία δεν έγινε άμεσος σχεδιασμός.
ΣΥΝΤΟΝΙΣΤΗΣ Καθ. Ν. Κατής
ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΕΡΓΟΥ 24.1.2012 - 23.1.2015
ΕΜΠΛΕΚΟΜΕΝΟ ΠΡΟΣΩΠΙΚΟ Δρ. Χ.Βαρβέρη, Δρ Ν. Βασιλάκος, Δρ Ν. Σκανδάλης,
Δρ Μ. Χολέβα, I. Μαλανδράκη Χ. Καράφλα, Π.Ε. Γλυνός,
Σ. Δρακούλης
ΣΧΕΤΙΚΗ ΕΝΟΤΗΤΑ “ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ” 2.1.2
2.3.2 Διμερής Ε & Τ Συνεργασία Ελλάδας-Κίνας 2012-2014 της Δράσης Εθνικής
Εμβέλειας «Διμερείς, Πολυμερείς και Περιφερειακές Ε & Τ Συνεργασίες», έργο:
Small RNA-mediated antiviral agri-biotechnology (sRNAvac)
Αντικείμενο του προγράμματος αποτελεί η διέγερση του μηχανισμού άμυνας των φυτών έναντι
φυτοπαθογόνων οργανισμών με χρήση μικρών μορίων RNA (‘RNA εμβόλια’) που προκαλούν ‘σίγηση’
της έκφρασης γονιδίων του παθογόνου. Ως πειραματικά μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν τα
παθοσυστήματα: α) CMV-τομάτα, β) ZYMV-καρπουζιά και γ) TYLCV-τομάτα. Η στρατηγική
παραγωγής αυτών των ‘RNA εμβολίων’ βασίζεται στη χρησιμοποίηση βακτηριακών κυττάρων και την
επαγωγή ετερόλογης έκφρασης σε αυτά των εν λόγω μορίων. Για κάθε μελετώμενο ιό επιλέχθηκαν
δύο γονίδια στόχοι. Για κάθε γονίδιο επιλέχθηκαν συντηρημένες περιοχές για το σχεδιασμό εκκινητών
για PCR, τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε ειδικούς πλασμιδιακούς φορείς και τελικά οι
πλασμιδιακές κατασκευές εισήχθησαν με μετασχηματισμό σε ειδικά βακτηριακά κύτταρα. Τα
μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή των ως άνω RNA
μορίων (in vivo παραγωγή). Συνολικά πραγματοποιήθηκε παραγωγή έξι (6) διαφορετικών ‘RNA
εμβολίων’, και η προστατευτική δράση τους αξιολογήθηκε με εφαρμογή σε φυτά τομάτας για τον ιό
TYLCV, σε κολοκυνθοειδή για τον ιό ZYMV και σε φυτά πιπεριάς για τον ιό CMV.
Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση δειγμάτων ολικού RNA από φυτά τα οποία κατά τις
βιοδοκιμές αξιολόγησης της δράσης των RNA εμβολίων παρουσίασαν διαφορετικό φαινότυπο ως προς
την ανθεκτικότητα στον αντίστοιχο ιό. Ειδικότερα, τα δείγματα ολικού RNA τα οποία εξετάστηκαν
προέρχονταν από φυτά που είχαν δεχτεί επέμβαση με: 1) έναν από τους μελετώμενους ιούς, 2) έναν
από τους μελετώμενους ιούς σε συνδυασμό με ένα αντίστοιχο ‘RNA εμβόλιο’ (dsRNA), ή 3) νερό
(αρνητικός μάρτυρας). Με την ανάλυση διερευνήθηκε η παρουσία μικρών (21-25 nt) μορίων RNA
(siRNAs) στα δείγματα ολικού RNA. Για την ανίχνευση των siRNAs πραγματοποιήθηκε διαχωρισμός σε
αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαμίδης, ηλεκτρομεταφορά τους σε νάυλον μεμβράνη, υβριδισμός με
μη ραδιενεργό ανιχνευτή και εφαρμογή της μεθόδου χημειοφωταύγειας (chemiluminescence) για την
ανίχνευσή τους. Τα αποτελέσματα ανίχνευσης των siRNAs θα συγκριθούν με εκείνα που θα
προκύψουν από μία PCR-βασιζόμενη τεχνική ανίχνευσης των μικρών RNAs που είναι υπό εξέλιξη και
τα αποτελέσματα αλληλούχησης νέας γενιάς (deep sequencing) που επίσης είναι υπό επεξεργασία.
Τέλος, πραγματοποιήθηκε Συστηματική Ανασκόπηση της βιβλιογραφίας για άλλες υπάρχουσες μη-
διαγονιδιακές μεθόδους που στοχεύουν στην αντιμετώπιση των μελετώμενων παθογόνων, με τις
οποίες θα μπορούσε ενδεχομένως να συνδυαστεί η μέθοδος εφαρμογής των ‘RNA εμβολίων’.
ΣΥΝΤΟΝΙΣΤΗΣ ΕΡΓΟΥ GeORION Ltd
ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΕΡΓΟΥ Επικ. Καθ. Α. Βολουδάκης (Γεωπονικό Πανεπιστήμιο
Αθηνών
ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΥΠΕΥΘΥΝΗ ΓΙΑ ΤΟ ΜΦΙ Δρ Μ.Κ. Χολέβα
ΕΜΠΛΕΚΟΜΕΝΟ ΠΡΟΣΩΠΙΚΟ ΜΦΙ Δρ Μ.Κ. Χολέβα, Χ. Ρέππα (Συνεργάτης με σύμβαση
εργασίας ιδιωτικού δικαίου ορισμένου χρόνο στο
Πρόγραμμα)