Page 129 - 2009

Α. Ερευνα - Εφαρμογές - Παρατηρήσεις

128

2 φορές τότε υπάρχει διαφορά ενός κύκλου. Οπότε για n κύκλους, η διαφορά στην ποσό-

τητα του mRNA είναι 2

n

. Για να ελέγξουμε ότι όντως έχει σχηματιστεί το σωστό προϊόν, το

μηχάνημα κάνει μια καμπύλη τήξης (melting curve) για να υπολογιστεί το σημείο τήξης

του προϊόντος. Όλα τα προϊόντα του PCR για το ίδιο ζευγάρι εκκινητών πρέπει να έχουν

το ίδιο σημείο τήξης, αλλιώς σημαίνει ότι υπάρχουν προσμίξεις, διμερισμός των εκκινη-

τών ή υβριδισμός σε λάθος σημείο του cDNA. Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για

το Real-time PCR είναι το εξής:

Φάση 1. (1X) Βήμα 1: 95,0°C για 10 λεπτά

Φάση 2. (45X) Βήμα 1: 95,0°C για 30 δευτερόλεπτα

Βήμα 2: 56,0°C για 1 λεπτό. Τα δεδομένα της αντίδρασης έχουν συγκε-

ντρωθεί και αρχίζει η ανάλυση.

Φάση 3. (80X) Βήμα 1: 55,0°C για 10 δευτερόλεπτα. Μετά τον δεύτερο κύκλο η θερ-

μοκρασία αυξάνεται κατά 0,5°C μέχρι τους 95,0°C για τον προσδιορισμό της καμπύλης

τήξης (melting curve).

Χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές (primers) ειδικά σχεδιασμένοι για αυτή την τεχνική και

ελεγμένοι με τη μέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων ως προς την ικανότητά τους να απο-

δίδουν σωστά τις ποσοτικές διαφορές στα επίπεδα του mRNA. Εκτός από τους εκκινητές

για τα CYP1A1/2 χρησιμοποιήθηκαν και εκκινητές για ακτίνη. Οι εκκινητές που χρησιμο-

ποιήθηκαν σχεδιάστηκαν με βάση το πρόγραμμα Primer3 (version 0.4.0) και είναι με κα-

τεύθυνση 5’-3’:

ratCYP1A1:

Καταρροϊκός: TAA CTC TTC CCT GGA TGC CTT CAA

Aναρροϊκός: GTC CCG GAT GTG GCC CTT CTC AAA

ratCYP1A2:

Καταρροϊκος: ACC CTG AGT GAG AAG GTG AT

Aναρροϊκός: GAG GAT GGC TAA GAA GAG GA

rat β-actin:

Καταρροϊκος: AAC CCT AAG GCC AAC CGT GAA AAG

Aναρροϊκός: CGA CCA GAG GCA TAC AGG GAC AAC

Αποτελέσματα

Η ποσοτική σχέση στην επαγωγή των mRNA των CYP1A1/2 από τις υπό εξέταση ου-

σίες απεικονίζεται στην Εικόνα 1. Η σχετική ποσοτικοποίηση στην έκφραση των mRNA

υπολογίστηκε με βάση τη μέθοδο ΔΔC

T

(Livak και Schmittgen. 2001,

Methods

25(4): 402-

408). Μετά την κανονικοποίηση των δειγμάτων με το mRNA αναφοράς που σε αυτή την

περίπτωση είναι το mRNA της β-ακτίνης επίμυος (rat β-actin), βρέθηκε ότι μόνο η υψηλή

δόση της καφεΐνης (100 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) επάγει τοξικολογικά σημαντι-

κά το CYP1A1 (18 φορές επαγωγή) ενώ η μικρή δόση της καφεΐνης καθώς και η μαστίχα

επάγουν το mRNA 1,5 και 3,5 φορές αντίστοιχα. Όσον αφορά στο CYP1A2 βρέθηκε ότι

η υψηλή δόση καφεΐνης επάγει το σχηματισμό RNA κατά 2,6 φορές ενώ η μικρή δόση

της καφεΐνης καθώς και η μαστίχα δεν επάγουν το σχηματισμό mRNA (1,2 και 0,75 φο-

ρές αντίστοιχα). Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν ένδειξη ότι η χορήγηση μαστίχας στη

φαρμακευτική δόση των 2000 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα δεν επάγει τη μεταγρα-

φή των ενζύμων CYP1A1 και CYP1A2, τα οποία ευθύνονται για την μεταβολική ενεργο-