Page 125 - 2009

Α. Ερευνα - Εφαρμογές - Παρατηρήσεις 124
22.Δραστικότητα ενζύμου παρόμοιας δραστικότητας με CYP1A1 στον πεπτι-
κό αδένα του μυδιού Mytilus galloprovincialis μέσω μέτρησης EROD.
Η ύπαρξη του σημαντικού κυτοχρώματος CYP1A1 στα θηλαστικά το οποίο μεταβολί-
ζει μια σειρά αρωματικών υδρογονανθράκων προς καρκινογόνα ενδιάμεσα παράγωγα
δεν έχει αποδειχθεί στα μαλάκια. Εντούτοις αυτές οι ενώσεις επίσης μεταβολίζονται στα
μύδια προς βιολογικώς δραστικά παράγωγα. Η απαλκυλίωση της ethoxyresorufin (ER)
προς resorufin αποτελεί κλασικό δείκτη δραστικότητας ενζύμων της οικογένειας CYP1A
για τα θηλαστικά όπως ήδη αναφέρθηκε και μετριέται φθοριομετρικά. Η απαλκυλίωση
της ER στα μύδια δεν μπορεί να συνδεθεί άμεσα με κάποια τοξικολογική δραστηριότητα
όπως η ενεργοποίηση προς καρκινογόνους μεταβολίτες, όμως δείχνει οτι τα μύδια εί-
ναι ικανά να επιτελέσουν κλασικές αντιδράσεις μεταβολισμού Φάσης Ι όπως οξείδωση,
απαλκυλίωση και υδροξυλίωση. Μύδια Mytilus galloprovinciallis από μη ρυπασμένη περι-
οχή της Εύβοιας (Λιχάδα) μεταφέρθηκαν στο ΜΦΙ και μετά από εγκλιματισμό 12 ωρών πε-
ρίπου ένας αριθμός θανατώθηκε και ο πεπτικός αδένας τους υποβλήθηκε σε περαιτέρω
διαδικασία. Συγκριμένα οι αδένες διαλύθηκαν σε σακχαρόζη-Tris-HCl το οποίο περιείχε
10 μl/ml mammalian protease inhibitor cocktail (Sigma, USA). Ο ιστός ομογενοποιήθηκε
(IKA ultra-turrax T 25, IKA) για 1 min και μετά υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση 10,000 g για
30 min στους 4º C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε αμέσως για την μέ-
τρηση δραστικότητας ethoxyresorufin-o-deethylase (EROD.) Η περιεκτικότητα σε πρω-
τεΐνη καθορίστηκε μέσω της μεθόδου Bradford. Ο ρυθμός δημιουργίας resorufin μετρή-
θηκε φθοριομετρικά (φθορισμόμετρο Jasco FP-6200 στα 520/590 nm) σε κυψελίδες που
περιείχαν 50 μl δείγματος και 10 μl υποστρώματος σε διάλυμα φωσφορικών αλάτων 0.1
Μ, μέσω της προσθήκης 100 μl NADPH. Η αντίδραση έλαβε χώρα για 60 min στους 30°C.
Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν ανά mg πρωτεΐνης. Η ίδια διαδικασία πραγματο-
ποιήθηκε για μύδια που διατηρήθηκαν σε συνθήκες ενυδρείου για 15 ημέρες. Υπήρξε
στατιστικά σημαντική μείωση της δραστικότητας EROD (0.50 ± 0.47 pmol/min/mg, 1.36
± 0.60 pmol/min/mg, P< 0.05, Student’s t-test, 5 ή 6 δείγματα) μετά τον εγκλιματισμό για
15 ημέρες. Αυτό καταδεικνύει την πιθανότητα πως η παρουσία οργανοχλωριωμένων ή/
και άλλων ρυπαντών στην γενικότερη περιοχή καθώς και στην ίδια την περιοχή της Λιχά-
δας οι οποίοι επάγουν το κυτόχρωμα που πραγματοποιεί οξειδωτικές αντιδράσεις Φάσης
Εικόνα 1. Καμπύλη αναφοράς συγκέντρωσης πρωτεϊνών κατά Bradford (595nm).