Page 121 - 2009

Α. Ερευνα - Εφαρμογές - Παρατηρήσεις 120
Ο ιστός των βραγχίων μεταφέρθηκε σε διάλυμα 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-
ethanesulfonic acid (HEPES) κατατεμαχίστηκε με την βοήθεια πλαστικής πιπέτας Pasteur
και υποβλήθηκε σε διαδοχικές φυγοκεντρήσεις. Το τελικό ίζημα επαναδιαλύθηκε σε διά-
λυμα HEPES (150 μl) και διατηρήθηκε σε πάγο μέχρι περαιτέρω χρήση.
Ο ιστός του πεπτικού αδένα μεταφέρθηκε σε παγωμένο διάλυμα ΗEPES-NaOH (10mL)
το οποίο βρισκόταν σε πλατφόρμα υπό κυκλική κίνηση (Innova2000, Brunswick). Κάθε 30
min, 2 ml διαλύματος αφαιρούνταν και αντικαθίσταντο από φρέσκο διάλυμα ΗEPES-
NaOH. Μετά από αυτήν την επώαση σε πάγο (2 h), 8 ml από το διάλυμα υποβλήθηκαν σε
διαδοχικές φυγοκεντρήσεις. Το τελικό ίζημα επαναδιαλύθηκε σε διάλυμα HEPES-NaOH
(150 μl) και διατηρήθηκε σε πάγο μέχρι περαιτέρω χρήση.
H αιμολέμφος αφαιρέθηκε από τον προσαγωγό μυ του ζώου μέσω σύριγγας (βελόνα
23G σε σύριγγα 1 mL). Περίπου 100 μl αφαιρέθηκαν από κάθε ζώο και χρησιμοποιήθηκαν
χωρίς περαιτέρω επεξεργασία.
Το διάλυμα που παράχθηκε κατά τις προαναφερθείσες διαδικασίες αναμίχθηκε με τηγ-
μένη αγαρόζη χαμηλού σημείου ζέσεως (LMPA) και απλώθηκε κατά μήκος μιας καλυμμένης
με αγαρόζη κανονικού σημείου ζέσεως (ΝMPA αντικειμενοφόρου). Οι αντικειμενοφόροι
εμβαπτίστηκαν σε παγωμένο διάλυμα λύσης (100 ml) μέσα σε υάλινο δοχείο Coplin και
αφέθηκαν εκεί σε θερμοκρασία 4oC για 1 h καλυμμένες με αλουμινόχαρτο. Μετά το πέρας
της μιας ώρας οι αντικειμενοφόροι μεταφέρθηκαν σε οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης
η οποία περιείχε διάλυμα ηλεκτροφόρησης pH=13.0 όπου αφέθηκαν για 30 min σε σκο-
τάδι. Εν συνεχεία υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση με το ίδιο διάλυμα για 20 min, στα 20
V/200 mA. Τέλος οι αντικειμενοφόροι πλύθηκαν με διάλυμα εξουδετέρωσης και βάφτηκαν
με ιωδιούχο προπίδιο (20 μg/mL, 50 μL). Οι αντικειμενοφόροι εξετάσθηκαν σε φθορίζον
μικροσκόπιο (Zeiss AxioCam MRC, Carl Zeiss Inc., Γερμανία) σε μεγέθυνση Χ 200 και έγινε
φωτογραφική αποτύπωση 40 κυττάρων ανά αντικειμενοφόρο (80 ανά μύδι). Εν συνεχεία
οι φωτογραφίες αναλύθηκαν με το πακέτο (TriTekCometScoreΤΜ) το οποίο υπολογίζει την
παράμετρo % DNA in tail. Η διάμεσος των 80 κυττάρων ανά μύδι υπολογίσθηκε και τα
δεδομένα υποβλήθηκαν σε έλεγχο ομοσκεδαστικότητας, κανονικής κατανομής και ίσων
διαφορών. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε two-way ANOVA (ανεξάρτητες παράμετροι
δόση/ιστός, εξαρτημένη παράμετρος % DNA in tail) προκειμένου να εντοπιστεί στατιστι-
κά σημαντική διαφορά μεταξύ των δόσεων και μεταξύ του είδους των ιστών. Ένας είδος
post-hoc τεστ (Tukey’s HSD test) πραγματοποιήθηκε προκειμένου να οριστούν οι διαφορές
μεταξύ των συγκρινόμενων πειραματικών ομάδων (Λ. Οικονόμου, Εργαστήριο Βιολογικού
Ελέγχου Γεωργικών Φαρμάκων). H επεξεργασία έγινε μέσω του προγράμματος SPSS16.0
for Windows και στατιστικά σημαντική διαφορά θεωρήθηκε σε επίπεδο Ρ< 0.05. Τα απο-
τελέσματα κατέδειξαν στατιστικά σημαντική εξάρτηση του % DNA in tail από τον εξετα-
ζόμενο ιστό (F= 79.81, P< 0.0002) και στατιστικά σημαντική εξάρτηση του % DNA in tail
από την εξεταζόμενη δόση (F=52.31, P<0.0001). Επίσης υπήρξε σημαντική αλληλεπίδραση
ιστού*δόσης, (F=6.78, P< 0.0003) δηλαδή η γονοτοξική ανταπόκριση της κάθε πειραματι-
Πίνακας 2. Βιοσυσσώρευση του Thiram στους μαλακούς ιστούς του M. galloprovincialis.
Treatment Thiram (μg/kg d.b.w.)
Μάρτυρας Μη ανιχνεύσιμο
0.1 mg/L Μη ανιχνεύσιμο
1.0 mg/L 214
10.0 mg/L 1780