Page 127 - 2009

Α. Ερευνα - Εφαρμογές - Παρατηρήσεις 126
χορηγήθηκε σε 3 ζώα ανά ομάδα, καφεΐνη σε δόσεις 0, 30 και 100 mg/kg σωματικού βά-
ρους/ημέρα καθώς και μαστίχα σε δόση 2000 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα για 3
συνεχόμενες ημέρες. Η δόση της μαστίχας επιλέχθηκε διότι αποτελεί τη μέγιστη φαρ-
μακευτική δόση που συνίσταται να λαμβάνεται από τον άνθρωπο. Η χαμηλή δόση της
καφεΐνης που επιλέχθηκε αντιστοιχεί στη μέση ημερήσια λήψη καφεΐνης που λαμβάνεται
από έναν ενήλικα ενώ η υψηλή αντιστοιχεί σε υπερβολική ημερήσια δόση και χρησιμο-
ποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας για την επαγωγή των CYP1A1 και CYP1A2. Μετά το πέρας
των χορηγήσεων τα ζώα θυσιάστηκαν κάτω από συνθήκες ασφυξίας με CO2 . Ακολούθως,
έγινε αφαίμαξη με έγχυση (perfusion) PBS μέσω της πυλαίας φλέβας των ζώων με σκο-
πό την απομάκρυνση της περίσσειας του αίματος από το ήπαρ. Στη συνέχεια τμήματα
ήπατος βάρους 50-100 mg συλλέχθηκαν και αποθηκεύθηκαν στους -80οC αφού πρώτα
παγώθηκαν άμεσα (snap frozen) σε υγρό άζωτο. Στη συνέχεια ξεκίνησε η διαδικασία της
απομόνωσης RNA.
Απομόνωση RNA από ιστό
Η απομόνωση RNA από ιστό έγινε με χρήση του αντιδραστηρίου TRIzol (Invitrogen), σύμ-
φωνα με τις οδηγίες της εταιρείας. Η μέθοδος αυτή είναι σύντομη και παρέχει τη δυνατότητα
απομόνωσης RNA ακόμη και από μικρές ποσότητες κυττάρων ή ιστού. Επιπλέον, η απόδοση
είναι υψηλή και το RNAπου απομονώνεται είναι ελεύθεροDNA και πρωτεϊνών, ενώπαραλαμ-
βάνεται το σύνολο των μορίων RNA (συμπεριλαμβανομένων και των μικρών 4-5 S RNA).
Η αρχή της μεθόδου περιγράφεται από τους Chomczynski and Sacchi (1987), πρέπει
δε να σημειωθεί ότι όλα τα χρησιμοποιούμενα υλικά και διαλύματα είναι αποστειρωμέ-
να για να αποφευχθεί η παρουσία ριβονουκλεασών. Συγκεκριμένα, το τμήμα του ιστού
διαλύεται σε διάλυμα TRIzol στους 0°C, σε αναλογία 1 ml αντιδραστηρίου για 50-100
mg ιστού. Μετά την ομογενοποίηση, προστίθενται 200 μl χλωροφορμίου και ακολουθεί
έντονη ανάδευση και επώαση στους 0°C για 5 min. Το δείγμα φυγοκεντρείται στα 12.000
g, στους 4°C, για 15 min, συλλέγεται η υδατική πάνω φάση και καταβυθίζεται με προ-
σθήκη ίσου όγκου ισοπροπανόλης για 20 min στον πάγο. Το ίζημα που προκύπτει μετά
από φυγοκέντρηση, επαναδιαλύεται σε διπλά απεσταγμένο H2O και προστίθεται σε αυτό
διάλυμα LiCl σε τελική συγκέντρωση 2,5 Μ. Το LiCl έχει την ικανότητα να καταβυθίζει επι-
λεκτικά το RNA και έτσι χρησιμοποιείται για την απομάκρυνση τυχόν προσμίξεων DNA.
Μετά από επώαση στους 4°C για 30 min και φυγοκέντρηση, το ίζημα επαναδιαλύεται σε
διπλά απεσταγμένο H2O και καταβυθίζεται με προσθήκη 0,3 Μ CH3COONa και 2,5 όγκων
απόλυτης αιθανόλης, για 16-20 ώρες στους -70°C. Ακολουθεί φυγοκέντρηση, απόχυση
του υπερκειμένου, προσθήκη αιθανόλης 75% κ.ο. και δεύτερη φυγοκέντρηση. Το ίζημα
επαναδιαλύεται σε διπλά απεσταγμένο H2O. Όλες οι φυγοκεντρήσεις που αναφέρονται
γίνονται σε 12.000 g, στους 4°C για 15 min. To RNA διατηρείται στους -70°C παρουσία 0,3
Μ CH3COONa και 75% κ.ο. αιθανόλης. Για να χρησιμοποιηθεί φυγοκεντρείται, το ίζημα
ξηραίνεται και διαλυτοποιείται σε διπλά απεσταγμένο H 2O. Στη συνέχεια 5 μl από αυτό
αραιώνεται σε 1 ml διπλά απεσταγμένο H2O και σαρώνεται φωτομετρικά στην περιοχή
300-240 nm. Απουσία προσμίξεων (DNA, πρωτεΐνες) το φάσμα εμφανίζει μέγιστο στα 260
nm και ο λόγος της ΟΑ στα 260 και 280 nm είναι ΟΑ 260 / ΟΑ280 =1,5-2. Μία μονάδα οπτικής
πυκνότητας στα 260 nm, αντιστοιχεί σε 40 μg RNA στο 1 ml του αραιωμένου δείγματος
που χρησιμοποιήθηκε για τη φωτομέτρηση.
Ηλεκτροφόρηση RNA σε πήκτωμα αγαρόζης
Μετά τη μέτρηση των δειγμάτων, 2-3 μg RNA (από κάθε δείγμα) αναμιγνύονται με 5