Page 128 - 2009

Έκθεση Εργασιών 2009 127
όγκους διαλύματος διαλυτοποίησης (56,7% κ.ο. απιονισμένο φορμαμίδιο, 12% κ.ο. δια-
λύματος 10X MOPS, 2,23 Μ φορμαλεΰδη, 7,3% κ.ο. γλυκερόλη, 5,7% κ.ο. κορεσμένου
διαλύματος χρωστικής μπλε της βρωμοφαινόλης). To διάλυμα 10X MOPS περιέχει: 0,2 Μ
MOPS pH: 7,0, 50 mM CH3COONa, 10 mM EDTA. Τα δείγματα θερμαίνονται στους 65°C για
10 min, στη συνέχεια μένουν στους 0°C για τον ίδιο χρόνο και τέλος τοποθετούνται στο
πήκτωμα αγαρόζης. Η σύσταση του πηκτώματος αγαρόζης είναι: 1,2% κ.β. αγαρόζη, 0,02
Μ MOPS pH: 7,0, 5 mM CH 3COONa, 1 mM EDTA, 0,63 M φορμαλεΰδης, 20 μl βρωμιούχο
αιθίδιο (10 mg/ml). H ηλεκτροφόρηση γίνεται σε διάλυμα 1X MOPS και με εφαρμογή ηλε-
κτρικού πεδίου 30-40 V για το χρόνο που απαιτείται.
Σύνθεση της πρώτης αλυσίδας του συμπληρωματικού DNA (cDNA)
Για τη σύνθεση της πρώτης αλυσίδας του συμπληρωματικού DNA, 1,5 μg ολικού RNA
μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας το kit της Invitrogen (SuperScriptTM First-Strand
Synthesis System for RT-PCR) σύμφωνα με το πρωτόκολλο της εταιρίας χρησιμοποιώντας
ως εκκινητές ολιγο dT. Το cDNA φυλάσσεται στους -20°C.
Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης με χρήση αντίστροφης μεταγραφάσης σε
πραγματικό χρόνο (RT-qPCR)
Η αντίδραση χρησιμοποιήθηκε για να ποσοτικοποιήσουμε διαφορές στην έκφραση
του mRNA των CYP1A1 και CYP1A2 σε σχέση με την ουσία που είχε χορηγηθεί. Για να
παρακολουθήσουμε τη σύνθεση του DNA, χρησιμοποιήθηκε η χρωστική Sybr green,
η οποία δένεται στη διπλή έλικα του DNA αλλά όχι στη μονή. Είναι πολύ σημαντικό να
εξετάζουμε την αντίδραση όταν αυτή βρίσκεται στη γραμμική της φάση, δηλ. στο πολύ
αρχικό μέρος της καμπύλης παραγωγής του cDNA. Για την αντίδραση χρησιμοποιήθηκε
το όργανο Mastercycler® ep realplex της εταιρείας Eppendorf. Τα δείγματα μπαίνουν σε
πλάκα 96 θέσεων. Για την κάθε αντίδραση, που έχει τελικό όγκο 25 μl χρησιμοποιείται 12,5
μl από το βασικό μίγμα 2× (Invitrogen), 1,5 περίπου μg cDNA και 25 pmol από τον κάθε
εκκινητή. Το μηχάνημα περιέχει μια ευαίσθητη κάμερα η οποία καταγράφει το φθορισμό
σε κάθε θέση της πλάκας σε συχνά διαστήματα κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Καθώς
το cDNA συντίθεται, περισσότερο SYBR green δένεται και ο φθορισμός αυξάνεται. Το
όργανο είναι συνδεδεμένο με έναν υπολογιστή και το αντίστοιχο λογισμικό χρειάζεται
για να καταγραφεί η αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο. Για να βεβαιωθούμε ότι οι
εκκινητές (primers) που επιλέξαμε μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ποσοτικοποίηση
των δειγμάτων, τους εξετάσαμε ως εξής: Το cDNA αραιώνεται κατά 10 φορές με τη μέθο-
δο των διαδοχικών αραιώσεων. Καθώς το δείγμα αραιώνεται χρειάζεται περισσότερους
κύκλους για να γίνει το προϊόν διακριτό. Αντιδράσεις οι οποίες διαφέρουν κατά 2 φο-
ρές στην ποσότητα του αρχικού cDNA διαφέρουν κατά 1 κύκλο οπότε τα δείγματα που
έχουν αραιωθεί κατά 10 φορές περιμένουμε να διαφέρουν κατά 3,3 κύκλους. Μπορούμε
να σχηματίσουμε διάγραμμα με τον αριθμό των κύκλων σε συνάρτηση με την ποσότητα
του αρχικού cDNA. Το αποτέλεσμα είναι ευθεία γραμμή. Από την κλίση της ευθείας και
χρησιμοποιώντας τηv εξίσωση 10 (-1/κλίση) μπορεί να υπολογιστεί η αποδοτικότητα των εκ-
κινητών. Οι εκκινητές χρησιμοποιούνται μόνο εφόσον το αποτέλεσμα της εξίσωσης είναι
περίπου 2 που σημαίνει ότι η αποδοτικότητα της μεθόδου είναι 100%. Για να υπολογιστεί
τελικά η διαφορά στην ποσότητα του αρχικού cDNA δηλ του mRNA του δείγμτος, χρη-
σιμοποιείται η παρακάτω εξίσωση: Λόγος αύξησης: 2 ΔCt του υπό εξέταση γονιδίου / 2ΔCt
του γονιδίου αναφοράς. Το ΔCt είναι η διαφορά στον αριθμό των κύκλων Ct μεταξύ δύο
δειγμάτων. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω εάν η διαφορά στην ποσότητα του mRNA είναι