Page 118 - 2009

Έκθεση Εργασιών 2009 117
ίζημα επαναδιαλυτοποιήθηκε σε διάλυμα Tris HCl–αλάτων, ζυγίστηκεκε σε δεύτερο δε-
καδικό ψηφίο και φυγοκεντρήθηκε σε 100.000 g για 1 h (Sorvall Ultracentrifuge). Το ίζημα
επαναδιαλυτοποιήθηκε σε διάλυμα φωσφορικών αλάτων 0.1 M/ γλυκερόλης 20% και η
πρωτεΐνη του ποσοτικοποιήθηκε με την μέθοδο Bradford.
Η δραστικότητα EROD υπολογίσθηκε με βάση την μέθοδο Burke et al., 1985,
Biochemical Pharmacology 34:3337-3345, με τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα στο διάλυμα
επώασης προστέθηκαν 5 μM υποστρώματος (ER), 90 μg πρωτεΐνης παρασκευάσματος
και αντίστοιχος όγκος διαλύματος φωσφορικών αλάτων (0.1 M, pH 7.6), μέχρι τελικού
όγκου 2 mL. To διάλυμα ισορροπήθηκε για 2 min στους 37ºC και στην συνέχεια προ-
στέθηκαν 250 μM NADPH. Η αντίδραση προχώρησε για 2 min στους 37ºC και ο ρυθμός
παραγωγής resorufin υπολογίσθηκε ως pmol resorufin/min/mg protein από την αύξηση
απορρόφησης στα 550/582 nm (φθορισμόμετρο Jasco FP-6200). Η καφεΐνη, η οποία είναι
επαγωγέας του κυτοχρώματος CYP1A1/2 προκάλεσε αύξηση της δραστικότητας EROD
κατά 2,5 φορές σε σχέση με τον μάρτυρα (n=2)
(Xριστίνα Εμμανουήλ, Αικατερίνη Κυριακοπούλου και Κυριακή Μαχαίρα)
19.Μελέτη των γονοτοξικών επιδράσεων της έκθεσης σε χημειοθεραπευτικά
φάρμακα σε νοσηλευτές, με τη χρήση της μεθόδου comet assay.
Στα πλαίσια της ανάπτυξης μεθόδου προσδιορισμού γονοτοξικής δράσης χημικών
ουσιών μελετήθηκε η πλέον ύποπτη ομάδα για ανάλογη δράση, οι χημειοθεραπευτικές
ουσίες.
Τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα αποτελούν μια κατηγορία ισχυρών φαρμάκων με ση-
μαντική τοξική δράση. Στη συγκεκριμένη έρευνα σκοπός ήταν η μελέτη των ανεπιθύμη-
των γονοτοξικών επιδράσεων που μπορεί να προκαλούνται σε άτομα του νοσηλευτικού
προσωπικού που εκτίθενται σε αυτά τα φάρμακα. Ανάλογη επίδραση έχει παρατηρηθεί
και σε ψεκαστές που εκτίθενται σε γεωργικά φάρμακα.
Ένας απλός και αξιόπιστος δείκτης γονοτοξικότητας είναι η μέτρηση θραυσμάτων
στις μονές αλυσίδες DNA στο κύτταρο, οι οποίες δείχνουν εάν ο οργανισμός εκτέθηκε
πρόσφατα σε έναν τέτοιο παράγοντα. Η μέτρηση αυτή γίνεται με τη μέθοδο ηλεκτρο-
φόρησης μεμονωμένων κυττάρων (SCGE ή comet assay), τα οποία προέρχονται από το
αίμα των υπό μελέτη πληθυσμών. Στην συγκεκριμένη μελέτη η συγκεκριμένη μέθοδος
εφαρμόστηκε σε κύτταρα αίματος (λεμφοκύτταρα) που συλλέχτηκαν από νοσηλευτές
που εκτίθενται σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα (πειραματική ομάδα) και από νοσηλευ-
τές που δεν εκτίθενται σε αυτά (ομάδα ελέγχου).
Συνοπτικά, κατά την τη SCGE μέθοδο μεμονωμένα κύτταρα εγκλείονται σε πήκτωμα
αγαρόζης πάνω σε αντικειμενοφόρες πλάκες, ακολουθεί λύση των κυττάρων, επώαση
και ηλεκτροφόρηση κάτω από αλκαλικές συνθήκες και τέλος χρώση και παρατήρηση
της εικόνας του DNA του κάθε κυττάρου. Το DNA ως αρνητικά φορτισμένο μόριο κατά
τη φάση της ηλεκτροφόρησης μεταναστεύει προς την άνοδο, αλλά τα τμήματα του DNA
που φέρουν SSB κινούνται πιο γρήγορα από τα ακέραια τμήματα. Αποτέλεσμα του γε-
γονότος αυτού είναι να δημιουργείται μια εικόνα με τη μορφή κομήτη (comet) όταν στο
κύτταρο υπάρχουν τέτοιου είδους καταστροφές του DNA. Η «ουρά» αυτού του κομήτη
(πυκνότητα ή/και μήκος) είναι ευθέως ανάλογη των μικρών μονών αλυσίδων που δημι-
ουργήθηκαν και επομένως ανάλογη της βλάβης που χαρακτηρίζει το κύτταρο. Η ποσοτι-